LABORATORIO #2

LABORATORIO #2

Mitos y verdades de la prueba directa de la antiglobulina.

En 1945 describieron (Coombs, Mourant y Race) una técnica para demostrar la presencia de Ac no aglutinantes (IgG) en el suero de pacientes. Esta técnica, inicialmente técnica o prueba de la antiglobulina, y con el paso de los años como técnica de Coombs, sigue siendo uno de los recursos más importantes, si no el que más, para el diagnóstico inmunohematológico de una serie de procesos clínicos de naturaleza inmune.

A diferencia de los Acs de clase IgM, cuya estructura pentamérica les permite aglutinar directamente a los hematíes, los Acs de clase IgG reaccionan con los hematíes sin llegar a aglutinarlos. Es necesaria alguna estrategia adicional para que se produzca la aglutinación esperada. El reactivo conocido como suero antiglobulina contiene una anti-inmunoglobulina humana IgG que se une a la porción Fc de las inmunoglobulinas (Igs) IgG estableciendo una conexión entre los diferentes Acs IgG fijados a los hematíes, permitiendo la aparición de la aglutinación deseada, lo que confirma la presencia de Acs no aglutinantes (IgG) en el suero del paciente.

El suero antiglobulina se obtuvo en su origen mediante la inmunización de conejos o cabras con suero humano que provocaba la producción de anti-Igs, preferentemente dirigidas en contra de las Igs clase IgG, así como frente a determinadas fracciones del complemento. Actualmente, el reactivo antiglobulina poliespecífico está constituido por una mezcla de anti-IgG y anticomplemento (anti-C3d y, en algunos casos, anti-C3c), y los reactivos monoespecíficos pueden ser diversos, si bien en la rutina diaria sólo suelen emplearse los que reconocen por separado a las Igs de clase IgG y a las fracciones mencionadas de complemento, respectivamente.

La prueba Coombs directo detecta los Ac adheridos a la membrana eritrocitaria y el Coombs indirecto detecta Ac libre en suero.

Prueba indirecta de la antiglobulina o prueba de Coombs indirecto.

La prueba de Coombs indirecta se utiliza para detectar anticuerpos dirigidos contra antígenos de hematíes, distintos de los antígenos ABO. Se realiza siempre que se prevé una transfusión de sangre. Si se detecta algún anticuerpo, debe procederse a una prueba de identificación de anticuerpos para conocer cual de ellos está presente. Al verificar la compatibilidad entre donante y receptor, y en el caso de que se detecten anticuerpos, se realiza una prueba de Coombs indirecta modificada. Es importante que la sangre del donante no contenga los antígenos frente a los cuales el receptor presenta ya anticuerpos.

Ac irregulares: Corresponden a aquellos Ac distintos a los Ac naturales del sistema ABO, que pueden aparecer en respuesta a la exposición a un Ag eritrocitaria extraño (transfusión o trasplante), por incompatibilidad materno-fetal o sin un estímulo identificable. En algunos casos, su presencia se asocia a la exposición a Ag ambientales, bacterianos o virales de características bioquímicas similares a los Ag eritrocitarios.

Esta prueba indirecta de la antiglobulina (PIATG) o prueba de Coombs indirecto tiene como objetivo demostrar que algunos pacientes eran portadores de Acs incompletos que sólo podían evidenciarse con la ayuda del reactivo antiglobulina (1). Hoy en día, continúa siendo la técnica fundamental para el escrutinio e identificación de Acs irregulares y para la prueba cruzada en el contexto de las pruebas de compatibilidad transfusional. La prueba consta de 4 fases:

1. Sensibilización o incubación. Consiste en poner en contacto el suero problema con los hematíes para que tenga lugar la reacción antígeno-anticuerpo.

2. Lavados. El objetivo es eliminar todas las Igs inespecíficas que no se hayan fijado a los hematíes. Esta fase es crítica para obtener un resultado correcto. La presencia de Igs residuales, fruto de un lavado inadecuado, puede neutralizar al suero antiglobulina y producir un falso resultado negativo.

3. Fase de la antiglobulina. Consiste en añadir el reactivo antiglobulina después del último lavado para que se fije a los Acs que se hayan unido a los hematíes y se acabe produciendo la aglutinación.

4. Control. En las reacciones negativas, cuando no se ha producido aglutinación, debe verificarse el resultado añadiendo hematíes sensibilizados con Acs IgG. Si el resultado negativo es correcto, la antiglobulina libre producirá la aglutinación de estos hematíes control. Por el contrario, la ausencia de aglutinación indicará que el Suero antiglobulina está en mal estado, tal vez neutralizado, y el resultado de la prueba original no puede aceptarse como válido.

Prueba directa de la antiglobulina o prueba de Coombs directo

Fue concebida posteriormente para demostrar la presencia de Acs IgG o de fracciones del sistema complemento fijadas in vivo a los hematíes del paciente en diversas situaciones clínicas, tales como la anemia hemolítica autoinmune (AHAI), la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido, las reacciones transfusionales y las anemias hemolíticas inducidas por fármacos.

En este caso, la técnica no requiere de una fase de incubación puesto que los hematíes a examinar ya están sensibilizados in vivo, pero las fases siguientes son idénticas, y el lavado de los hematíes sigue siendo crucial para evitar el fenómeno de neutralización del reactivo antiglobulina.

Las muestras de sangre extraídas sobre EDTA son las más adecuadas, ya que el EDTA previene la fijación in vitro de complemento a través de la acción quelante ejercida sobre el calcio, cuya intervención es necesaria para la activación de la fracción C1 del complemento.

Existe una cierta relación entre el número de moléculas de IgG fijadas a los hematíes y la intensidad de la reacción. Petz y Garratty (3) estimaron:

En los casos en que la prueba es positiva para IgG y complemento debe excluirse una autoaglutinación espontánea de los hematíes incubando éstos con un control de albúmina al 6% o con un control salino. La ausencia de aglutinación con este control asegura una interpretación correcta del resultado positivo y, por el contrario, si los hematíes son aglutinados con este control, el resultado previo se invalida y cabe pensar que la aglutinación de los hematíes del paciente viene producida por una fijación extrema de Igs de clase IgG o, más raramente, por Igs de clase IgM reactivas a 37ºC o por autoaglutininas frías IgM que no se han disociado durante los lavados.

La determinación del Coombs directo es fundamental para el diagnóstico de la AHAI. El valor predictivo de esta prueba positiva es de 83% en pacientes con AH. En individuo sano pueden estar presente en condiciones normales entre 5-90 moléculas de IgG/eritrocito y 5-40 de C3b (ambos niveles están por debajo de la capacidad de detección del reactivo antiglobulina).

Un Coombs directo positivo por aumento del nivel de IgG o complemento, pero sin clara relación con anemia, se ha observado en pacientes afectados por drepanocitosis, B-talasemia, enfermedad renal, mieloma múltiple, enfermedad autoinmune, SIDA y procesos que cursan con altos niveles de globulinas o urea. Por ello, para interpretar el Coombs directo, se debe evaluar también la historia clinica del paciente.

LISS/Coombs (directa e indirecta)

Los reactivos de antiglobulina humana -AGH- poliespecíficos se utilizan para detectar e identificar aloanticuerpos (Ac producidos al reconocer aloantigenos -ej: trasplante-), pruebas de compatibilidad y Coombs directa. La función principal de AHG es de detectar IgG. La actividad anti-c3B es importante en Coombs directo en la investigación de la AHAI. Los microtubos de la tarjeta ID-Card “Liss/Coombs”, contiene AGH poliespecifica para detectar e identificar Ac, pruebas cruzadas y Coombs directo. La AGH en esta tarjeta no es específica para cadenas pesadas, por ello puede reaccionar con cadenas ligeras kappa y lambda de IgA e IgM.

Reactivos:

·         6 microtubos con AGH poliespecifica (anti-IgG de conejo y anti-C3b monoclonal) en la matriz del gel. Conservante <0.1% NaN3.

·         ID-Diluent 2: Solución LISS modificada para suspensiones de eritrocitos. à Solución Liss: Usado para reducir fuerza iónica del medio para detectar e identificación de Ac y pruebas de compatibilidad. Este reactivo refuerza la interacción Ag-Ac durante la incubación. Medio para Resuspensión celular, conteniendo: Glicina, NaCl, Glucosa, Inosina, Adenina, Na2HPO4, KH2PO4, EDTA, NaOH, y como preservantes Sulfametoxazol y Trimetroprima. _{http://www.felsan.com.ar/productos/imagenes/insertos_certificados%20rediar/rediar%20instructivos%20pdf/Inst%20Liss%20Preservante.pdf}

·         ID-DiaCell, ID-DiaPanel: Eritrocitos de prueba.

Muestras:

Se debe determinar con una muestra recién extraída. La muestra debe recogerse utilizando citrato, EDTA o CPD-A. si se usa suero en vez de plasma, someterlo a centrifugación 1500 g por 10 minutos antes de usar, evitando presencia de residuos de fibrina que interferiría al patrón de reacción.

Preparación de la muestra:

I. Suspensión de eritrocitos para Coombs directa o autocontrol:

Prepare la suspensión al 0.8% en ID-Diluent 2 (dejar que tome temperatura ambiente): 1) Pipetear 1.0 mL ID-Diluent en un tubo limpio; 2) Añadir 1.0 uL de sedimento de eritrocitos y agite suavemente. (puede usarse la suspensión inmediatamente)

II. Suspensión de eritrocitos para determinar prueba cruzada:

Prepare la suspensión al 0.8% en ID-Diluent 2 (dejar que tome temperatura ambiente): Use directamente la sangre total de un segmento de la tubulatura de la bolsa de sangre, añada 20 uL de sangre a 1.0 mL de ID-Diluent 2.

III. Plasma o suero para Coombs indirecto.

Cuando las muestras no se analicen inmediatamente, deben conservarse 2-8ºC después de la separación; máximo 48 horas, y después a -20ºC.

Procedimiento.

I. Coombs directo.

a. Marcar microtubos correspondientes de la tarjeta ID-Card “Liss/Coombs, con el nombre o número del paciente/donante.

b. Retirar la lámina de sellado solo del microtubo a usar, manteniendo la tarjeta ID-Card en posición vertical.

c. Pipetee 50 uL de la suspensión de eritrocitos en el microtubo correspondiente.

d. Centrifugue durante 10 minutos en ID-Centrifuga.

e. Lea y registre resultados.

II. Detección de Ac (Coombs indirecto, usar eritrocitos listos para usar ID-DiaCell)

a. y b. similar al primero.

c. Pipetee 50 uL de cada reactivo de eritrocitos en el microtubo correspondiente (marcado con el correspondiente número de eritrocitos).

d. Si hay autocontrol, pipetear 50 uL de la propia suspensión de eritrocitos de la muestra.

e. Añadir 25 uL de plasma o suero del paciente/donante a cada microtubo.

f. Incube durante 15 minutos a 37ºC.

g. Centrifugue durante 10 minutos

h. Leer y registrar

III. Prueba de compatibilidad (Coombs indirecto).

a. y b. Similares a los anteriores.

c. Pipetear 50 uL de la suspensión de eritrocitos del donante en el microtubo.

d. – h. Similar al anterior.

Interpretación.

I. Principio: a) +: Eritrocitos aglutinados, forman una línea roja sobre la superficie del gel o aparecen dispersos en el gel; b) -: Sedimento compacto de eritrocitos en el fondo del microtubo.

II. Reacciones para:

a) Coombs directo: 1) Reacción negativa indica ausencia de IgG o componente del complemento C3b; 2) reacción positiva (+/- a ++++) indica que los eritrocitos del paciente están sensibilizados (están recubiertos con Ac IgG, C3b o ambos)

b) Detección de Ac (Coombs indirecto): 1) Reacción negativa indica ausencia de Ac irregulares detectables en suero/plasma del paciente/donante; 2) Reacción positiva indica presencia de estos Ac. Introduzca las reacciones obtenidas en la table de Ag. Compruebe que el número del lote de los eritrocitos reactivos corresponde con el numero indicado en la tabla de Ag; 3) Según el patrón de las reacciones y la configuración de Ag, puede indicarse el tipo de Ac; 4) Reacción positiva a 1 o más tipos de eritrocitos y un autocontrol negativo sugieren presencia de Ac especifico; 5) Reacción positiva a todos los eritrocitos y un autocontrol positivo puede deberse a reacciones no específicas.

c)  Prueba de compatibilidad (Coombs indirecto): 1) reacción positiva indica presencia de Ac irregulares, (similar al anterior, numeral 2); 2) Según el patrón de las reacciones y la configuración de Ag, el tipo de Ac presente puede identificarse en la mayoría de los casos (el autocontrol debe dar negativo);

DC-Screening I. Coombs directa. IgG, IgA, IgM, C3c, C3b, ctl.

Un resultado + en Coombs directo con AGH poliespecificos, indicarían que los eritrocitos están recubiertos in vivo con Ig, complemento o ambos. Para diferenciar la reacción se usan reactivos AGH monoespecificos (anti-IgG, -IgA, -IgM, -C3, -C3c, -C3b y -C4)

Las muestras similares a la anterior.

Preparación muestras (suspensión de eritrocitos, no es necesario lavar eritrocitos antes de realizar la suspensión): 1) Dispense 1 mL de ID-Diluent 2 en un tubo; 2) añada 10 uL de eritrocitos concentrados y agitar suavemente.

Procedimiento:

a. Identificar la ID-Tarjeta con el nombre o número del paciente/donante.

b. Retirar la lámina de sellado solo del microtubo a usar, manteniendo la tarjeta ID-Card en posición vertical.

c. Pipetee 50 uL de la suspensión de eritrocitos en cada microtubo.

d. Centrifugue la tarjeta por 10 minutos.

e. leer y registrar.

Interpretación:

A) Principio: I) +: los eritrocitos aglutinados forman línea roja sobre la superficie del gel o aparecen dispersos en el gel; II) - : Sedimento compacto de eritrocitos al fondo.

B) Reacciones monoespecíficas.

El control negativo debe mostrar reacción negativa.

Los resultados obtenidos pueden ayudar a definir un cuadro clínico. Pacientes con AHAI por Ac calientes tienen en la mayoría de los casos, eritrocitos recubiertos por IgG, si bien pueden detectarse complemento -C3 en aproximadamente 24% de los casos-; igualmente se puede presentar IgM e IgA.

En la enfermedad de aglutinina fría, el resultado habitual es que solo se detecte complemento como recubrimiento del eritrocito, pero se puede detectar simultáneamente IgM, IgA o ambas. La hemoglobinuria paroxística por frio puede mostrar inicialmente recubrimiento por complemento, salvo que se salven con suero salino frio (4ºC), donde se puede detectar autoAc IgG. Para diferenciar ambas patologías se usa la prueba de Donath-Landsteiner.

Coombs Directo:

1. Reactivos e insumos

·         Tarjeta/ID-Card Liss coombs (AGH poliespecífica. Coombs Anti-IgG+C3d)

·         Diluyente 2 (solución Liss, para realizar la dilución de hematíes)

·         Puntas

·         Pipetas

·         Muestra de pacientes (1, 2, 3, 4, 5, 6) en tubo tapa lila (EDTA, CPD-A O heparina).

·         Centrifuga

·         Banjo

2. Instrucciones detalladas:

·         Marque los pozos correspondientes a 6 pacientes con el nombre o número del paciente.

·         No utilice tarjetas que presenten signos de desecación o burbujas o cuyos cierres no estén intactos.

·         Realice dilución de hematíes al 1% (1000ul de solución Liss y 10ul de glóbulos rojos).

·         Dispense 50ul de la dilución al 1% en cada pozo.

·         Centrifugue 10 minutos a 1030 rpm

·         Leer e interpretar reacción de aglutinación (Banjo)

·         Una reacción negativa indica la ausencia de anticuerpos IgG o componente del complemento C3d detectables en los eritrocitos

·         Una reacción positiva indica que los eritrocitos del paciente están sensibilizados (eritrocitos recubiertos con anticuerpos IgG, C3d o ambos).

·         En caso de obtener resultados positivos, realice coombs fraccionado.

Coombs Fraccionado:

Realice Coombs fraccionado en caso de haber obtenido un resultado positivo en Coombs directo, para diferenciar la inmunoglobulina o complemento que se encuentra recubriendo los glóbulos rojos del paciente in vivo; utilizando reactivos AGH monoespecíficos, tales como anti-IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, Ctl.

1. Reactivos e insumos:

·         Tarjeta DC-screening I (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, Ctl)

·         Diluyente 2 (solución Liss, para realizar la dilución de hematíes)

·         Puntas

·         Pipetas

·         Muestra de paciente (1) en tubo tapa lila (EDTA, CPD-A O heparina).

·         Centrifuga

·         Banjo

2. Instrucciones detalladas:

·         Marque la tarjeta correspondiente a 1 paciente con el nombre o número del paciente.

·         No utilice tarjetas que presenten signos de desecación o burbujas o cuyos cierres no estén intactos.

·         Realice dilución de hematíes al 1% (1000ul de solución Liss y 10ul de glóbulos rojos).

·         Dispense 50ul de la dilución al 1% en cada pozo.

·         Centrifugar 10 minutos a 1030 rpm

·         Leer e interpretar reacción de aglutinación (Banjo)

Taller del Laboratorio #2 – MTI Eje 2.

1. ¿Qué son Anticuerpos irregulares?

Para contextualizar, desde el punto de vista de la medicina transfusional, los anticuerpos contra antígenos sanguíneos se categorizan:

·         Anticuerpos contra aloantígenos: Producidos contra antígenos de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

·         Anticuerpos contra los propios antígenos: Conocidos como autoanticuerpos contra los antígenos de eritrocitos, plaquetas y fibras colágena.

Con lo anterior, se puede considerar a los últimos anticuerpos como irregulares o adquiridos, dividiendo los aloanticuerpos:

·         Regulares naturales: Producidos contra el sistema ABO (anti-A y anti-B).

·         Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1, anti-E, etc.

·         Irregulares adquiridos o inmunes: antisistema Rh-Hr (anti-D, anti-c, anti-D, etc), anti-Kell y anti-Duffy.

Entonces, los anticuerpos del sistema ABO surgen una vez el individuo tiene contacto con el medio ambiente. Para precisar los anticuerpos regulares, se debe identificar en todos los individuos, por regla general, y que los manifestaran durante toda su vida. Mientras los anticuerpos irregulares, son aquellos distintos a los anticuerpos naturales del sistema ABO, pudiéndose presentar ante la respuesta por exposición a un antígeno eritrocitario extraño (por trasplante o transfusión), incompatibilidades entre madre y feto o por estimulo no identificable. En determinados casos se le asocian por exposición a antígenos ambientales y microbiológicos de características bioquímicas similares a los antígenos eritrocitarios. Los anticuerpos más comunes en donantes: anti-Le, anti-K y anti-E; y en los pacientes: anti-D, anti-E y anti-K.

Para los anticuerpos naturales regulares, su tipo son IgM (normalmente), fijando eficientemente el complemento, provocando lisis intravascular y ocasionalmente, insuficiencia renal o muerte. Para los anticuerpos adquiridos, son IgG, los cuales producen hemolisis extravascular (bazo o hígado), por fagocitosis por el sistema fagocítico mononuclear del complejo eritrocito + anticuerpo.

2. ¿Qué es la elusión en medicina de transfusión?

Este tiene mucha relación a la Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), donde se deberá investigar el tipo de anticuerpo (IgG) que está recubriendo las células y produce la reacción hemolítica. Una manera para investigar ese anticuerpo es mediante elusión; en este proceso se despegan moléculas de anticuerpos de los eritrocitos sensibilizados, el anticuerpo puede ser despegado por la modificación de la termodinámica de las reacciones antígeno-anticuerpo, por neutralización o inversión de las fuerzas de atracción que mantienen unidos los complejos, teniéndose:

·         Elusión por calor: Buena para investigar EHRN por ABO por lesionar la membrana del eritrocito.

·         Elusión por solventes orgánicos: Xileno, cloroformo, tricloroetileno, tricloroetileno-cloroformo, usados para anticuerpos IgG y IgM. Lesiona la membrana del eritrocito.

·         Elusión acida: Glicina-HCl con pH de 1.5, rompe el complejo antígeno-anticuerpo; usada para anticuerpo IgG (sin lesionar la membrana eritrocitaria). Presentan otros tipos de elusión, los cuales pueden si lesionar la membrana.

3. ¿De qué trata la Anemia Hemolítica Autoinmune por anticuerpos calientes? Y ¿Cómo se trata este tipo de AHAI?

Este tipo de anemia está relacionada al daño por el mecanismo de tolerancia inmunitaria hacia los antígenos de los glóbulos rojos. La etiología de este tipo de anemia puede comprender estados fisiológicos hasta idiosincrásicos. Se presenta un defecto en la autorregulación de los linfocitos T supresores, los cuales inactivan la producción de anticuerpos por los linfocitos B. al perder la autorregulación, se producen cantidades elevadas de anticuerpos, desencadenando la máxima destrucción de glóbulos rojos. Esta AHAI por anticuerpos calientes, es la más común de las AHAI (70% de los casos) y la causa de la hemolisis es que los anticuerpos actúan a temperatura corporal (37ºC).

El tratamiento de la AHAI por anticuerpos calientes va determinado por la severidad de la hemolisis. Si se presenta regeneración medular que compensa la tasa de hemolisis y no hay anemia, sería suficiente dar ácido fólico y seguir la evolución del paciente; pero en los casos graves, se deberán tomar medidas terapéuticas. En la bibliografía, indica unos tratamientos adecuados para esta AHAI:

·         Glucorticoides. Medicamentos considerados de primera elección para estos pacientes cuando comienza el desarrollo de la anemia, con dosis iniciales altas (1-2 mg/kg/día), las cuales se van disminuyendo según la mejoría clínica del paciente. En cuadros clínicos más graves, se debe iniciar el tratamiento con dosis altas de metilprednisona intravenosa (100-200 mg diarios) La respuesta positiva se puede ver en 3-4 días y con una respuesta del 80%. Pero los pacientes que no responden a la primera semana, probablemente no lo harán después y se les consideran pacientes refractarios y es necesario tomar otras líneas de tratamiento. Estos corticoides reducen la hemolisis por disminución del consumo de glóbulos rojos por el bazo, como también la cantidad de anticuerpos producidos.

·         Esplenectomía. Indicada cuando se evidencia resistencia a esteroides, por ello, es la segunda línea de tratamiento para pacientes refractarios al anterior. Su efectividad es variable (60-75% de casos), pero igualmente se presentan recaídas y es necesario corticoides para mantener al paciente (dosis menores). Su potencial beneficio se basa: 1) La hemolisis extravascular se da en el bazo y, 2) El bazo es un órgano productor de anticuerpos. Con lo anterior, la esplenectomía disminuye la anemia a través de las características previas.

·         Transfusiones. Las transfusiones de concentrados de glóbulos rojos se utilizan en casos críticos. Porque estos glóbulos rojos transfundidos pueden destruirse igual o más rápido que los del paciente, pero pueden salvarle la vida. Las reacciones transfusionales son un riesgo potencial, por lo difícil de encontrar donantes compatibles.