LABORATORIO #1

LABORATORIO #1

PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGICAS

 Hemoclasificación en Microplaca

Reactivos e insumos:

·         Microplaca (con anticuerpos monoclonales listas para usar, para determinación de grupo ABO/Rh D).

·         Diluyente 1 (Solución Bromelina -enzima-) Las enzimas proteolíticas modifican los antígenos eritrocitarios con lo que aumentan la reactividad de algunos sistemas de grupo sanguíneo (en especial los del sistema Rh), aunque suprimen otros como los antígenos de los sistemas MNSs, Duffy y Xg.

·         Puntas

·         Pipetas

·         Células A1, A2, B (DiaCell-MP ABO)

·         Muestra en tubo tapa lila (EDTA, CPD-A O heparina)

·         Centrífuga

·         Xylo o Lyra

Instrucciones detalladas:

·         Marque los pozos según corresponda con la numeración de la muestra a montar.

·         No utilice pozos que presenten signos de desecación o cuyos cierres no estén intactos.

·         Dispense 50 ul del plasma a los 3 pozos de fase inversa (pozos A 1, B1, C1)

·         Dispense 50ul de Células A1, A2 Y B en pozos de fase inversa (pozos A 1, B1, C1)

·         Realice la dilución al 1% de hematíes. (1000ul de Bromelina y 10ul hematíes) deje a temperatura ambiente 10 minutos, máximo 30 minutos.

·         Dispense 50ul de la dilución en pozos D1,E1,F1,G1,H1 de fase directa o globular.

·         Realice lo mismo con los demás pacientes.

·         Recuerde no destapar pozos que no va a utilizar, pues contribuye al deterioro de los componentes de la Microplaca.

Los pozos de la Z a la E contienen: H (anti-A), G (anti- B), F y E (para grupo D [Rh], DVI- y DVI+)

·         Centrifugue 90 segundos a 900rpm (Diacent MP-2)

·         Agitar

·         Leer e interpretar (XYLO o LYRA)

Hemoclasificación directa tarjeta ABD (Diaclon ABD Confirmación):

Recuerde realizar tarjeta ABD a bebes y a todos los pacientes con solicitud de hemocomponentes, ya que es el primer filtro para confirmar la hemoclasificación en Microplaca y garantizar resultados confiables.

Reactivos e insumos:

·         Tarjeta/ID “Diaclon ABD-Confirmation”

·         Diluyente 2 (solución Liss, para realizar la dilución de hematíes) utilizado para reducir la fuerza iónica del medio de reacción en los procedimientos de detección e identificación de anticuerpos y en las pruebas de compatibilidad. La presencia de este reactivo refuerza la interacción antígeno anticuerpo durante la incubación. A diferencia de otras soluciones de baja fuerza iónica para resuspensión celular, este reactivo presenta la ventaja de evitar el deterioro de los antígenos durante 28 días. Los glóbulos rojos resuspendidos en esta solución pueden ser utilizados para técnicas en lámina, tubo, microplaca o gel.

·         Puntas

·         Pipetas 

·         Muestra de pacientes (1,2) en tubo tapa lila (EDTA, CPD-A O heparina).

·         Centrifuga

·         Banjo

Instrucciones: 

·         Marque los pozos correspondientes a 2 pacientes con el nombre o número de paciente.

·         No utilice tarjetas que presenten signos de desecación o burbujas o cuyos cierres no estén intactos.

·         Realice dilución de hematíes al 5% (500ul de solución Liss y 25ul de glóbulos rojos).

·         Dispense 12,5ul de la dilución al 5% en cada pozo.

·         Centrifugar 10 minutos a 1030 rpm

·         Leer e interpretar reacción de aglutinación (Banjo)

Fenotipificación:

Recuerde realizar fenotipo a mujeres entre 4 meses y 42 años con expectativa obstétrica y/o en embarazo. Pacientes con síndromes mieloploriferativos y mielodisplásicos, anemia en estudio, enfermedad renal crónica, anemia drepanocítica o falciforme, talasemia, anemia aplásica.

Es necesaria la Fenotipificación ya que la presencia de estos antígenos C, Cw, c, E, e, Kell en los eritrocitos de las unidades transfundidas puede sensibilizar o estimular la producción de anticuerpos en pacientes negativos para C, Cw, c, E, e, Kell.

Reactivos e insumos:

·         Tarjeta/ID “Rh Subgroups C, Cw, c, E, e, Kell (Fenotipo)”

·         Diluyente 1 (solución Bromelina, para realizar la dilución de hematíes)

·         Puntas

·         Pipetas 

·         Muestra de paciente  en tubo tapa lila (EDTA, CPD-A O heparina).

·         Centrifuga

·         Banjo

Instrucciones:  

·         Marque la tarjeta correspondiente a 1 paciente con el nombre o número del paciente.

·         No utilice tarjetas que presenten signos de desecación o burbujas o cuyos cierres no estén intactos.

·         Realice dilución de hematíes al 5% (500ul de solución Bromelina y 25ul de glóbulos rojos).

·         Dispense 12,5ul de la dilución al 5% en cada pozo.

·         Centrifugar 10 minutos a 1030 rpm

·         Leer e interpretar reacción de aglutinación (Banjo)

Diaclon Anti-B, Anti-A y Anti-AB

Para Mollison, la frecuencia de los grupos sanguíneos del sistema ABO en caucásicos es: O 46%, A 41%, B 9% y AB 4%

Para detectar presencia o ausencia de Ag A (ABO1) y B (ABO2) en los GR se emplean los correspondientes Ac Anti-A, Anti-B y Anti-AB (pueden ser de origen humano o monoclonal, en el inserto enviado estos provienen del sobrenadante de cultivos celulares de hidridomas murino, siendo del tipo inmunoglobulina M, estos son específicos para Ag A (ABO1) y B (ABO2)). La determinación del grupo ABO no puede considerársele completa, sin someter el suero del paciente a una prueba inversa frente a GR A₁, A₂, B y O conocidos.

Reactivos (todos tratados como potencialmente infecciosos):

-          Ac monoclonales (hibridoma murino), en frascos de 10 mL (listo, no diluir) Conservante <0.1% NaN3, estable entre 2-8ºC

·         DiaClon Anti-A [línea celular A5]

·         DiaClon Anti-B [línea celular G ½]

·         DiaClon Anti-A [línea celular Birma-1, ES-4, ES 131]

-          Solución salina isotónica al 0.9% para suspensión de GR.

-          Tubos de suspensión, gradilla para tubos, pipeta, portaobjetos, centrifuga inmunohematología, bastoncillos para mezclar, visor calefactado.

Observaciones:

-          Nivel elevado de aglutininas frías pueden provocar aglutinación. Se pueden evitar incluyendo una prueba inversa (determinación de isoaglutininas)

-          Ac DiaClon no rxn con criptoAg (ej. Ag T).

-          Anti-B de origen monoclonal no rxn con Ag B adquiridos.

Limitaciones:

-          Contaminación bacteriana o de otra índole, provocaría rxn falsamente + o –

-          Suspensiones de GR muy concentradas o muy diluidas, pueden dar lugar a resultados aberrantes.

DiaClon Anti-D. 

La expresión de Rh + o Rh – se basa en presencia o ausencia del Ag RhD en los GR. Para Mollison, el 85% de población caucásica es RhD +. Este DiaClon Anti-D contiene 2 Ac de la misma especificidad (IgG e IgM), de origen monoclonal pero que reconoce diferentes epítopos del Ag D.

Reactivos.

-          DiaClon Anti-D contiene Ac monoclonales correspondiente a IgG (línea celular MS-26) e IgM (línea celular TH-28), DVI son + en la prueba de antiglobulina indirecta. Concentración de albumina <6% (bovina), conservante <0,1% NaN3, estable 2-8ºC

-          Solución salina isotónica al 0.9% para suspensión dee GR.

-          DiaClon Coombs-serum

-          Coombs-Control IgG

-          DiaClon Rh-Control.

-          Tubos de suspensión, gradilla, pipeta, portaobjetos, bastoncillos, visor calefactado, centrifuga inmunohematología, estufa de incubación de 37ºC

Muestras: La determinación debe hacerse sobre una muestra recién extraída, con criterios de aceptabilidad de las muestras. Preferiblemente se debe recoger la muestra de sangre utilizando citrato, EDTA o CPD-A como anticoagulante. Puede utilizarse muestras de tubos sin anticoagulante.

Resultados.

I) Principio:

§  +: Una aglutinación entre + y ++++ indica una reacción entre el antisuero y los GR.

§  -: Ausencia de aglutinación visible, no hay reacción entre antisuero y GR. (valido si el control negativo no presenta aglutinación)

II) Reacciones para RhD:

§  Reaccion + (+ a ++++) indica presencia del Ag RhD.

§  Reacción – (no aglutina) indica ausencia del Ag RhD.

III) Reacciones para D en la prueba de antiglobulina indirecta (PAI):

Aglutinación entre +a ++++ con un resultado negativo con otras técnicas, indica presencia del Ag D débil o parcial, requiere ampliar la investigación para dilucidar la categoría del RhD.

Observaciones.

-  Resultado + en antiglobulina directa (DAT) invalida una reacción + en la prueba de Ag D débil (IAT)

DiaMed-MP Test (Microplacas con Ac monoclonales deshidratados, listas para usar, determinación de grupos ABO/RhD)

La determinación del grupo ABO no puede considerársele completa, sin someter el suero del paciente a una prueba inversa frente a GR A₁, A₂, B y O conocidos.

Para detectar la presencia (Rh+) o ausencia (Rh-) de los Ag D en GR son necesarios antisueros reactivos de especificidad anti-D. Las microplacas ofrecen una técnica sencilla (basta añadir suspensión de GR) que elimina la necesidad de llenar los pocillo con antisuero luquido. Todos los Ac están estandarizados a fin de obtener resultados claros y reproducibles.

Reactivos.

-          Microplacas con Ac monoclonales deshidratados y un control – (ctl). Contiene Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-D. Cada microplaca tiene código de barras para su identificación. Mantener a 2-8ºC.

-          GR reactivos para prueba sérica o inversa:

·         DiaCell-MP ABO A₁, A₂, B y O

·         DiaCell-MP ABO A₁, A₂, B

·         DiaCell-MP ABO A₁, B y O

·         DiaCell-MP ABO A₁ y B

DiaCell-MP ABO.

Los GR reactivos se emplean habitualmente en la serología de grupos sanguíneos para detectar presencia o ausencia de isoaglutininas anti-A y anti-B (Prueba inversa o grupo sérico). En la prueba inversa se empelan GR reactivo del grupo A₁ y B / A₁, A₂ y B / A₁, B y O o A₁, A₂, B y O; según los requerimientos del laboratorio.

-          ID-Diluent, solución de bromelina modificada para suspensiones de GR.

-          ID-Pipetor, tubos para suspensiones, ID-Dispenser para ID-Diluent, puntas de pipeta, centrifuga para microplacas.

Muestras: La determinación debe hacerse sobre una muestra recién extraída, con criterios de aceptabilidad de las muestras. Preferiblemente se debe recoger la muestra de sangre utilizando citrato, EDTA o CPD-A como anticoagulante. Puede utilizarse muestras de tubos sin anticoagulante. Cuando deba emplearse suero, debe someterse a centrifugación a 1500 g durante 10 min antes de usarlo, evitando la presencia de residuos de fibrina que interfieren con la reacción.

Lectura de las reacciones.

I)  Procedimiento manual

Después de la centrifugación, coloque la MP en un agitador y continue:

-          Agite vigorosamente de 2-3 seg para soltar GR sedimentados.

-          Agite de 1-2 min a velocidad media hasta que las reacciones – se resuspendan por completo.

-          Agite 1 min aproximadamente a velocidad mínima para que las masas de GR aglutinados (reacciones +) se reagrupen en el centro del pocillo.

-          Lea las reacciones inmediatamente después de la agitación. (después de 50 segundos los GR se sedimentan, tocaría volver a agitar la MP)

II) Procedimiento automático. La agitación y lectura puede realizarse automáticamente por un lector.

Resultados.

I. Principio. Aglutinación indica reacción entre Ag-Ac

Fuertemente +: Aglutinación completa o 2-3 aglutinados de GR agrupados en el fondo del pocillo y sobrenadante claro.

Débilmente positivo. Presencia de pequeños aglutinados de GR al fondo del pocillo, con sobrenadante con numerosos GR libres en suspensión.

Negativo. Sin aglutinación visible, lo que indica ausencia de reacción Ag-Ac.

II. Reacciones para grupos ABO.

III. Reacciones para RhD. Las reacciones + entre + y ++ indican presencia de Ag RhD

IV. Reacción con DiaCell-MP ABO (Prueba sérica o inversa).

Taller del Laboratorio #1 – MTI Eje 2.

1. ¿Cómo se producen los anticuerpos monoclonales?

Su producción inicio en 1975, consistiendo en la generación de una línea celular, la cual produciría un isotipo de inmunoglobulina contra antígeno especifico, por la fusión de 2 células diferentes por medios químicos y físicos. La primera célula es un linfocito B de un animal, previamente inmunizado con el antígeno de interés, aportando de esta manera la memoria inmune y producir anticuerpo. La segunda célula es la célula tumoral del mieloma no secretora de anticuerpos; de la unión de las células, aparece una célula inmortal con capacidad de producir anticuerpos monoclonales, llamada hibridoma. Desde el primer uso del anticuerpo monoclonal por hibridoma, en ocasiones se producían respuestas de hiperreactividad en los pacientes.

En 1985 se inició la creación de anticuerpos quiméricos humanos (base de ratón), mediante el DNA recombinante, unión la región variable de las Ig del ratón con la región constante humana, después de insertan a las células del mieloma, produciendo nuevos anticuerpos con una parte humana. Sin embargo, estos anticuerpos (quiméricos) son menos inmunógenos que los anteriores, pueden presentar reacción del tipo anticuerpo-antiquiméricos.

se tienen técnicas para poder generar anticuerpos monoclonales humanos como la expresión de las fracciones variables, Fab y ScFv, en bacterias. La tecnología del Fago es la más utilizada para desarrollar estos anticuerpos monoclonales humanos, con la guía de las bibliotecas de los genes de fagos que estarían codificando las regiones variables de Ig. 

2. ¿Por qué se debe realizar simultáneamente la prueba directa o globular con la prueba sérica o inversa?

Luego de revisar diversas fuentes, realizar solo la prueba directa puede pasarse por alto las discrepancias y subgrupos de la clasificación ABO. Igualmente, la prueba inversa estaría confirmando los resultados de la prueba directa, si no es así, debería llevarse a cabo las confirmaciones correspondientes. Si el profesional le cree a la directa y cree que posiblemente los anticuerpos en el suero están en bajo título, entonces se realizaría una nueva prueba inversa, pero con mayor concentración del reactivo y muestra.

3. ¿Diferencia entre Ac monoclonal y Ac policlonal? ¿Ventajas y desventajas?

Primero, los anticuerpos policlonales son aquellas inmunoglobulinas elaborados por distintos linajes de linfocitos B, aunque reconocen el mismo antígeno, se dirigen a diferentes epítopos del mismo. Y como se indicó anteriormente, los monoclonales son elaborados por un único clon de linfocitos B, con afinidad monovalente, por ende, solo reconocen un solo epítopo del mismo antígeno.

Las ventajas de usar uno o el otro tipo de anticuerpos: 

Anticuerpos monoclonales.

Ventajas:

·         Especificidad: Presenta una mayor especificidad, al solo reconocer un solo epítopo, disminuyendo las posibles reacciones cruzadas.

·         Reproducibilidad: No da variabilidad entre lotes, si las condiciones son estables durante el ensayo, los resultados son reproducibles.

·         Cantidad: Las hibridomas son células inmortales y pueden producir, ilimitadamente, los anticuerpos monoclonales.

Desventajas:

·         Producción: Desarrollar las hibridomas requiere de mucho tiempo, por ende, mayor costo y uso de tecnología más compleja con personal especializado. 

·         Intolerancia a los cambios en el antígeno: con solo reconocer un solo epítopo, si este sufre una modificación cualquiera, el anticuerpo pierde su actividad por no reconocer su blanco.

·         Especificidad: Es un inconveniente, porque al tener gran especificidad, cuando se necesite reconocer varias proteínas, pero con gran homología entre ellas.

Anticuerpos policlonales:

Ventajas:

·         Afinidad: al ser una mezcla de anticuerpos, siendo capaces de reconocer diferentes epítopos en la misma proteína, tienen una gran afinidad por el antígeno, permitiendo amplificar la señal por si las proteínas tienen bajos niveles de expresión o de cantidad. 

·         Tolerancia a cambios en el antígeno: Por reconocer diferentes epítopos, son menos sensibles a los cambios estructurales del antígeno blanco (como son polimorfismos, desnaturalización, heterogeneidad de las glicosilaciones).

·         Producción: Es relativamente rápido y sencillo, con menos coste.